Moreno no fue protagonista de la Semana de Mayo. No se lo escuchó como a Castelli en el famoso Cabildo del 22, ni anduvo por la plaza con los chisperos de French y Beruti. Su protagonismo comenzó el 25 de mayo de 1810, al asumir las Secretarías de Guerra y Gobierno de la Primera Junta. Desde allí desplegará toda su actividad revolucionaria. Bajo su impulso, la Junta produjo la apertura de varios puertos al comercio exterior, redujo los derechos de exportación y redactó un reglamento de comercio, medidas con las que pretendió mejorar la situación económica y la recaudación fiscal. Creó la biblioteca pública y el órgano oficial del gobierno revolucionario, La Gazeta, dirigida por el propio Moreno, que decía en uno de sus primeros números: "El pueblo no debe contentarse con que sus jefes obren bien; él debe aspirar a que nunca puedan obrar mal. Seremos respetables a las naciones extranjeras, no por riquezas, que excitarán su codicia; no por el número de tropas, que en muchos años no podrán igualar las de Europa; lo seremos solamente cuando renazcan en nosotros las virtudes de un pueblo sobrio y laborioso".
Por una circular del 27 de mayo de 1810, la Junta invitaba a las provincias interiores a enviar diputados para integrarse a un Congreso General Constituyente. En Buenos Aires, el ex virrey Cisneros y los miembros de la Audiencia trataron de huir a Montevideo y unirse a Elío (que no acataba la autoridad de Buenos Aires y logrará ser nombrado virrey), pero fueron arrestados y enviados a España en un buque inglés.
En Córdoba se produjo un levantamiento contrarrevolucionario de ex funcionarios españoles desocupados, encabezado por Santiago de Liniers. El movimiento fue rápidamente derrotado por las fuerzas patriotas al mando de Francisco Ortiz de Ocampo. Liniers y sus compañeros fueron detenidos. La Junta de Buenos Aires ordenó que fueran fusilados, pero Ocampo se negó a cumplir la orden por haber sido compañero de Liniers durante las invasiones inglesas. Moreno se indignó: "¿Con qué confianza encargaremos grandes obras a hombres que se asustan de una ejecución?" Encargó entonces la tarea a Juan José Castelli, quien cumplió con la sentencia, fusilando a Liniers y sus cómplices el 26 de agosto de 1810.
En julio de 1810, la Junta había encargado a Moreno la redacción de un Plan de Operaciones, destinado a unificar los propósitos y estrategias de la revolución. Moreno presentó el plan a la Junta en agosto, y le aclaró a su auditorio que no debía "escandalizarse por el sentido de mis voces, de cortar cabezas, verter sangre y sacrificar a toda costa. Para conseguir el ideal revolucionario hace falta recurrir a medios muy radicales".
En el Plan de Operaciones, Moreno propuso promover una insurrección en la Banda Oriental y el Sur del Brasil, seguir fingiendo lealtad a Fernando VII para ganar tiempo, y garantizar la neutralidad o el apoyo de Inglaterra y Portugal, expropiar las riquezas de los españoles y destinar esos fondos a crear ingenios y fábricas, y fortalecer la navegación. Recomendaba seguir "la conducta más cruel y sanguinaria con los enemigos" para lograr el objetivo final: la independencia absoluta.
A poco de asumir el nuevo gobierno, se habían evidenciado las diferencias entre el presidente, Saavedra, y el secretario Moreno.
Moreno encarnaba el ideario de los sectores que propiciaban algo más que un cambio administrativo. Se proponían cambios económicos y sociales más profundos. Pensaba que la revolución debía controlarse desde Buenos Aires, porque el interior seguía en manos de los sectores más conservadores vinculados al poder anterior.
"El gobierno antiguo nos había condenado a vegetar en la oscuridad y abatimiento, pero como la naturaleza nos ha criado para grandes cosas, hemos empezado a obrarlas, limpiando el terreno de tanto mandón ignorante."
Saavedra, en cambio, representaba a los sectores conservadores a favor del mantenimiento de la situación social anterior.
Un episodio complicó aun más la relación entre ambos. El 5 de diciembre de 1810, hubo una fiesta en el Regimiento de Patricios, para celebrar la victoria de Suipacha. Uno de los asistentes, el capitán de Húsares Atanasio Duarte, que había tomado algunas copas de más, propuso un brindis "por el primer rey y emperador de América, Don Cornelio Saavedra" y le ofreció a doña Saturnina, la esposa de Saavedra, una corona de azúcar que adornaba una torta.
Al enterarse del episodio, el secretario Moreno decretó el inmediato destierro de Atanasio Duarte, diciendo que "...un habitante de Buenos Aires ni ebrio ni dormido debe tener expresiones contra la libertad de su país"; prohibió todo brindis o aclamación pública a favor de cualquier funcionario y suprimió todos los honores especiales de que gozaba el Presidente de la Junta. La pelea entre Moreno y Saavedra estaba desatada.
Moreno, preocupado por los sentimientos conservadores que predominaban en el interior, entendió que la influencia de los diputados que comenzaban a llegar sería negativa para el desarrollo de la revolución. A partir de una maniobra de Saavedra, estos diputados se fueron incorporando al Ejecutivo, y no al prometido Congreso Constituyente. Moreno se opuso y pidió que se respetara la disposición del 27. Pero estaba en minoría y sólo recibió el apoyo de Paso.
Cornelio Saavedra, moderado y conciliador con las ex autoridades coloniales, había logrado imponerse sobre Mariano Moreno. Para desembarazarse de él lo envió a Europa con una misión relacionada con la compra de armamento. Moreno aceptó, quizás con la intención de dar tiempo a sus partidarios para revertir la situación, y quizás también para salvar su vida. Saavedra dio su versión de los hechos en una carta dirigida a Chiclana el 15 de enero de 1811: "Me llamó aparte y me pidió por favor se lo mandase de diputado a Londres: se lo ofrecí bajo mi palabra; le conseguí todo: se le han asignado 8.000 pesos al año mientras está allí, se le han dado 20.000 pesos para gastos; se le ha concedido llevar a su hermano y a Guido, tan buenos como él, con dos años adelantados de sueldos y 500 pesos de sobresueldo, en fin, cuanto me ha pedido tanto le he servido".
La fragata inglesa Fama soltó amarras el 24 de enero de 1811. A poco de partir Moreno, que nunca había gozado de buena salud, se sintió enfermo y le comentó a sus acompañantes: "Algo funesto se anuncia en mi viaje...". Las presunciones de Moreno no eran infundadas. Resulta altamente sospechoso que el gobierno porteño hubiera firmado contrato con un tal Mr. Curtís el 9 de febrero, es decir, quince días después de la partida del ex secretario de la Junta de Mayo, adjudicándole una misión idéntica a la de Moreno para el equipamiento del incipiente ejército nacional. El artículo 11 de este documento aclara "que si el señor doctor don Mariano Moreno hubiere fallecido, o por algún accidente imprevisto no se hallare en Inglaterra, deberá entenderse Mr. Curtís con don Aniceto Padilla en los mismos términos que lo habría hecho el doctor Moreno".
Al poco tiempo de partir Moreno hacia su destino londinense, Guadalupe, que había recibido en una encomienda anónima un abanico de luto, un velo y un par de guantes negros, comenzó a escribirle decenas de cartas a su esposo. En una de ellas le decía: "Moreno, si no te perjudicas, procura venirte lo más pronto que puedas o hacerme llevar porque sin vos no puedo vivir. No tengo gusto para nada de considerar que estés enfermo o triste sin tener tu mujer y tu hijo que te consuelen; ¿o quizás ya habrás encontrado alguna inglesa que ocupe mi lugar? No hagas eso Moreno, cuando te tiente alguna inglesa acuérdate que tienes una mujer fiel a quien ofendes después de Dios". La carta estaba fechada el 14 de marzo de 1811, y como las otras, nunca llegó a destino. Mariano Moreno había muerto hacía diez días, tras ingerir una sospechosa medicina suministrada por el capitán del barco. Su cuerpo fue arrojado al mar envuelto en una bandera inglesa. Guadalupe le siguió escribiendo sus fogosas cartas. Se enteró de la trágica noticia varios meses después, cuando Saavedra lanzó su célebre frase: "Hacía falta tanta agua para apagar tanto fuego". Los boticarios de la época solían describir los síntomas producidos por la ingesta de arsénico como a un fuego que quema las entrañas.
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